Cel·lulosa bacteriana: un apòsit autodegradable i sensible al pH

Cada any, 20 milions de persones pateixen hèrnies abdominals i l’única manera de curar-les és mitjançant la cirurgia. Dues de les complicacions postoperatòries més comunes de les operacions d’hèrnia són les adherències entre la malla i el teixit i els problemes a les ferides externes (com infeccions, desenvolupament de ferides cròniques…). Arrel d’aquest context, els professionals han començat a investigar com solucionar-ho amb l’ajuda d’un nou biomaterial cost-efectiu: la cel·lulosa bacteriana. El seu ús creixent en els sectors biomèdics i biotecnològics es deu a les seves propietats físiques, entre les quals hi ha ser antiadherent o absorbir els exsudats de les ferides provocant una millor cicatrització. No obstant, la cel·lulosa té un inconvenient: els humans som incapaços de digerir-la, per tant, si la col·loquesim dins del cos, necessitaríem d’una segona operació per extreure-la.

Per aquesta raó, l’objectiu del meu treball de recerca ha consistit en crear un apòsit de cel·lulosa bacteriana autodegradable (per evitar la segona operació) i sensible al pH (per poder veure a simple vista si una ferida externa està en condicions òptimes per curar-se).

La creació d’aquest apòsit s’ha dividit en dues parts, la primera és la creació de l’apòsit autodegradable (sobretot enfocat a ferides internes), i la segona és la creació de l’apòsit sensible al pH (sobretot enfocat a ferides externes).

Totes dues parts tenen com a denominador comú l’ús de tres materials essencials: els apòsits de cel·lulosa bacteriana (creats a partir de bacteris Komagataeibacter xylinus), les dissolucions tampó (dissolucions que els costa canviar el seu valor de pH i han estat utilitzades per simular ambients concrets) i el Simulated body fluid (SBF; solució que imita el plasma sanguini humà).

Primera part: apòsit autodegradable

Per poder obtenir un apòsit autodegradable, vam utilitzar cel·lulasa. La cel·lulasa és un enzim que hidrolitza la cel·lulosa (no digerible) i la converteix en glucosa (digerible) solucionant així el problema principal. Concretament, la que vam utilitzar va ser la T. reesei. Per aquesta raó, l’objectiu de la primera part va ser trobar la quantitat de cel·lulasa suficient a introduir dins l’apòsit per a) mantenir l’apòsit intacte durant 1 setmana (temps de recuperació de l’operació d’hèrnia) a uns valors de pH de 3 – 4 (valors que presenta una ferida) i b) passat aquest temps, degradar l’apòsit a uns valors de pH de 4 – 5 (valors que adopta la ferida quan s’està curant).

El primer pas a seguir va ser crear l’apòsit. En diferents Eppendorfs, vam barrejar 1.5 ml de dissolució tampó (amb els valors de pH de 3.5, 4 i 4.9) amb diferents concentracions de cel·lulasa (8, 10, 11.5 i 15 mg), i es van introduir 200 ul de les barreges als apòsits. En conseqüència, vam obtenir 12 tipus d’apòsits diferents.

Per comprovar que la cel·lulasa s’hagués adherit correctament a l’apòsit, el vam observar a través del SEM, i en les micrografies resultants vam poder comprovar que la cel·lulasa havia cristal·litzat a la superfície de la cel·lulosa i inclús es podien veure fibres de l’apòsit soltes que indicaven un inici de degradació.

Un cop vam tenir l’apòsit creat, tocava estudiar la seva degradació. Vam deixar els apòsits creats dins d’un pot amb SBF i vam agafar mostres del medi cada dos dies durant una setmana. Com que la cel·lulosa es va degradant, el medi va adquirint glucosa, i com més glucosa tingui el medi, més degradat estarà l’apòsit. Al tenir 12 tipus d’apòsit i agafar un total de 7 mostres, vam obtenir 84 mostres diferents. El següent pas consistia en quantificar exactament quanta glucosa contenia cada mostra i es va efectuar mitjançant el Trinder method. Aquest mètode consisteix a barrejar el reactiu GOD – POD amb solucions que continguin glucosa. Quan el reactiu entra en contacte amb la glucosa, canvia el color de la solució a una tonalitat vermellosa – rosada. Com més intens sigui el color, més glucosa contindrà la mostra i, per tant, més degradació presentarà l’apòsit. Un cop fetes les barreges, es passen totes per un espectrofotòmetre que en mesura l’absorbància, i amb l’ajuda d’una recta patró es poden conèixer les concentracions de glucosa. El problema que va presentar el nostre experiment, però, va ser que cap mostra tenia prou quantitat de glucosa per ser mesurada amb aquest mètode. No obstant, visualment es podia veure que els apòsits que portaven 10 dies degradant-se presentaven petits troços de cel·lulosa solts pel medi, però mantenint la forma inicial de l’apòsit (signe de degradació inicial), justament ajustant-se a la temporització que es buscava.

Tot i l’entrebanc, l’ICMAB em va permetre realitzar un TGA. El TGA és una tècnica que mesura els canvis de pes d’un material en relació a la temperatura i sabem que cada substància fon a una temperatura diferent. La limitació d’aquest test és que la mostra analitzada ha de tenir un mínim de pes determinat per la màquina, i com que en un principi no estava planejat fer aquestes anàlisis, només vam analitzar dues mostres: les de 15 mg (visualment semblaven donar el millor resultat), 11 dies de degradació (temps que s’ajusta a l’objectiu) i pH: 3.5 i 4. En els gràfics obtinguts es va veure com tots dos apòsits presentaven degradació, sent el de pH: 4 més degradat que el de pH: 3.5. Aquest resultat tenia lògica ja que el pic d’activitat de la cel·luasa T. reesei es troba a pH: 5.

Com a conclusions d’aquest apartat vam extreure el següent:

a) Per avaluar processos de degradació lents o petits, el TGA és més efectiu que el mètode GOD-POD.
b) Tant visualment com quantitativament s’ha vist que a l’onzè dia, la cel·lulosa ja presenta degradació (a més és una degradació inicial)
c) Falta determinar quan l’apòsit es degradaria completament.
d) S’entreveu que 15 mg és la quantitat més efectiva, tanmateix, falta determinar si les quantitats de cel·lulasa es poden optimitzar.

Segona part: apòsit amb indicacions de pH

L’objectiu de la segona part va ser introduir dins de la cel·lulosa bacteriana un indicador de pH orgànic per poder saber a simple vista si una ferida està en condicions òptimes per curar-se. Quan ens fem una ferida, el nostre pH disminueix a uns valors de 3 – 4, i a mesura que es va curant, el pH va augmentant fins a tornar al seu valor inicial (en el cas de la pell, 6 – 7).

L’indicador orgànic que vam utilitzar van ser les antocianines. Les antocianines es troben presents en aliments com la col llombarda i, a banda de ser orgàniques, tenen propietats antioxidants i una àmplia gamma de colors per als diferents valors de pH.

El primer pas de la segona part va ser extreure les antocianines d’una col llombarda. La vam triturar, banyar en etanol 80%, vam filtrar tota la solució i finalment, vam evaporar els dissolvents (etanol i aigua) amb l’ajuda d’un rotavapor. Un cop vam obtenir l’extracte final, el vam sotmetre a una prova de FTIR per comprovar que realment havíem obtingut antocianines. El FTIR et permet identificar els enllaços que presenta la teva mostra per així identificar la molècula. El gràfic que vam obtenir era pràcticament idèntic al d’una antocianina.

Un cop assegurat que teníem el nostre indicador de pH, vam fer tres proves per avaluar el seu funcionament. La primera prova va ser el test del canvi de color. Vam barrejar les antocianines amb diferents valors de pH i, efectivament, cada solució va adoptar el seu color pertinent. Tot i això, els colors del rang de pH que estàvem estudiant (3, 3.5, 4, 4.5; període de recuperació d’una ferida) eren molt similars com per diferenciar a simple vista i vam sotmetre les mostres a un test UV-Vis. Els gràfics resultants van mostrar que cada solució tenia una longitud d’ona diferent i, per tant, eren 4 colors diferents.

El següent test va ser el d’absorció i alliberació per mirar si les antocianines s’introduien a l’apòsit i es deixaven anar al medi (simulant la ferida). Per aquesta prova, vam banyar l’apòsit de cel·lulosa dins d’una solució d’antocianines durant dos dies. Passat el temps, l’apòsit havia adoptat el color de les antocianines, indicant que les havia absorbit. Després, vam col·locar aquest apòsit que contenia antocianines dins d’un pot amb SBF a pH 3 i vam anar agafant mostres del medi al llarg del temps. Un cop recollides, las vam analitzar en un UV-Vis i vam veure com al llarg del temps l’absorbància augmentava, indicant que les antocianines es deixaven anar. Concretament, vam poder afirmar que les antocianines funcionaven (i, per tant, donaven propietat d’indicació de pH a l’apòsit) durant aproximadament 1 dia.

L’últim test que vam realitzar va ser el test antioxidant per saber quant n’eren les antocianines. El funcionament d’aquest test consisteix a introduir un apòsit amb antocianines dins d’una solució de DPPH en metanol (substància lila) i deixar-ho reposar 8h. Passat el temps, si la mostra s’ha tornat groga, vol dir que és antioxidant, en canvi si es manté lila vol dir que no ho és. Els apòsits amb antocianines van donar positiu a la prova (es van tornar grocs) amb un 72% de DPPH scavenging.

Com a conclusions d’aquest apartat vam extreure el següent:

a) L’apòsit de cel·lulosa absorbeix i deixa anar les antocianines.
b) Les antocianines mantenen la seva indicació de pH dins l’apòsit (canvien de color).
c) El rang de colors de l’estudi presenta una tonalitat molt similar i costa diferenciar-los a simple vista.
d) Les propietats antioxidants de les antocianines són elevades i ajuden a una millor cicatrització.

Com a conclusió final, l’apòsit autodegradable funciona, però falta optimitzar la quantitat de cel·lulasa afegida, i l’apòsit sensible al pH pot funcionar durant un dia i et pot permetre diferenciar si una ferida està en bon estat o no, però no diferenciar en quin estat de cicatrització es troba ja que els colors són molt similars.

Com tota investigació científica, arribar a un producte final per llençar al mercat necessita molts mesos i moltes proves per reduir al mínim qualsevol imprevist no esperat. És per això que si ara pogués continuar perfilant l’apòsit, aquests serien els meus següents pasos:

a) Optimitzar la quantitat de cel·lulasa.
b) Introduir en un sol apòsit antocianines i cel·lulasa.
c) Quantificar el temps per degradar l’apòsit completament.
d) Comparar la degradació entre un film de cel·lulosa sec i un de mullat.
e) Repetir els experiments en unes condicions més reals.
f) Avaluar les antocianines amb altres valors de pH més diversos no utilitzats en aquest estudi.

Per acabar, m’agradaria donar les gràcies a l’ICMAB per proporcionar-me el laboratori i tots els materials necessaris, així com l’ajuda i l’aprenentatge ofert.

Si vols llegir més sobre TRs, fes click aquí…!